供稿人：張晨蕊、王玲、李滌塵 供稿單位：西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)布日期：2024-01-04
提出了新型的多組分微球（MCMs），具有共封裝和時(shí)空藥物釋放能力，用于肝癌術(shù)后的治療和肝再生。MCMs通過(guò)逐步微流控平臺(tái)制備，由海藻酸鈉（ALG）殼和甲基丙烯酸明膠（GelMA）芯組成。得益于“顆粒中顆?！苯Y(jié)構(gòu)，mcm提供了分別將阿奇霉素（DOX）和肝再生增強(qiáng)劑（ALR）加載到殼和核的可能性。此外，MCMs使DOX快速釋放，ALR更持續(xù)釋放。因此，雙載藥MCMs具有顯著的術(shù)后殺傷腫瘤和促進(jìn)肝再生的作用。
圖1介紹了多層載藥凝膠微球的制造過(guò)程，GelMA微球首先通過(guò)液滴微流控技術(shù)生成，并懸浮在海藻酸鈉溶液中。然后將溶液進(jìn)行電噴霧，通過(guò)氯化鈣誘導(dǎo)的交聯(lián)生成ALG微粒，并將GelMA微球嵌入在中?？鼓[瘤藥物DOX和肝再生增強(qiáng)劑（ALR）分別加入ALG和GelMA。由于“粒子中粒子”結(jié)構(gòu)，MCMs使DOX的初始快速釋放和隨后的ALR連續(xù)釋放。
圖1 由DOX負(fù)載ALG殼和ALR負(fù)載GelMA核組成的多組分微球示意圖
圖2介紹了MCMs的制造示意圖，并對(duì)制造出的水凝膠微球的尺寸及大小進(jìn)行了表征。首先MCMs是通過(guò)雙步微流控工藝制備的，制備了一個(gè)用玻璃毛細(xì)管構(gòu)建的微流控裝置來(lái)生成GelMA微球。該裝置由兩個(gè)玻璃毛細(xì)管組成，錐形尖端從相反的方向插入一個(gè)較大的方形毛細(xì)管。在該裝置中制備了油中水（W/O）單個(gè)乳化液滴。內(nèi)相流體為流過(guò)注射管的GelMA預(yù)凝膠溶液（10 wt%），外相流體為蓖麻油，流過(guò)注射管與方形毛細(xì)管之間的空隙。用一個(gè)裝滿相同油溶液的容器來(lái)收集液滴。然后，將得到的液滴暴露在紫外（UV）光下，通過(guò)光聚合生成GelMA微球。然后，將GelMA微球與海藻酸鈉溶液（1 wt%）混合，并進(jìn)行電噴霧，這種海藻酸鹽溶液是通過(guò)一個(gè)由單一的錐形圓柱形毛細(xì)管組成的電噴霧微流控裝置注入的，在典型電壓為6 kV的電場(chǎng)下形成液滴。內(nèi)部含有GelMA微球的ALG微滴落入一個(gè)裝滿氯化鈣溶液的容器中。ALG和Ca2+之間的快速離子交聯(lián)導(dǎo)致了固體ALG微粒的形成，GelMA微球嵌入在內(nèi)部，即MCMs。所制備的mcm具有獨(dú)特的顆粒間結(jié)構(gòu)。此外，通過(guò)調(diào)節(jié)微流控電噴霧參數(shù)，可以控制嵌入的GelMA微球的數(shù)量。通過(guò)改變GLG溶液中GelMA微球的體積比、電壓和流量，可以調(diào)節(jié)捕獲的GelMA微球的數(shù)量。隨著GelMA微球在ALG溶液中的體積比的增加，ALG液滴中含有更多的GelMA微球，因此最終的MCMs能夠封裝更多的GelMA巖芯。此外，隨著流量的增加或電壓的降低，液滴的體積增加，從而使更多的GelMA巖芯可以封裝在MCMs中。
圖2 (a)MCMs生成過(guò)程示意圖；（b-d）分別嵌入(b)單、(c)雙和(d)三重GelMA微球的MCMs的光學(xué)顯微圖像
所制備的MCMs具有獨(dú)特的顆粒間結(jié)構(gòu)。為了證實(shí)這一點(diǎn)，作者分別將DOX和BSA-FITC分別裝入ALG和GelMA微球中，在熒光顯微鏡下顯示出紅色和綠色熒光。通過(guò)熒光強(qiáng)度，以判斷藥物釋放的時(shí)間及隨時(shí)間變化藥物釋放規(guī)律。
圖3 DOX和BSA-FITC的體外釋放譜。(a)熒光圖像顯示(i) 0 h、（ii）1 h、（iii）2 h、（iv）3h、(v) 5 h、(i)7h后加載DOX的MCMs；不同pH值的PBS累積釋放曲線；(c)熒光圖像顯示加載BSA-FITC的GelMA微球(i) 0 h、（ii）12 h、（iii）、1d、（iv）2 d、（v）4d后的MCM；不同pH值的MCMs的BSA-FITC的(d)累積釋放曲線
為了研究MCMs在術(shù)后治療中體內(nèi)抗腫瘤的作用，構(gòu)建了小鼠H22原位肝癌模型。兩周后，我們切除90 %的腫瘤，切除部分鄰近肝組織，建立不完全腫瘤切除模型（圖4a）。此外，為了保證術(shù)后腫瘤體積的相對(duì)同質(zhì)性，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照、ALG、DOX、DOX-ALG和DOX/ALR MCMs組，如圖4所示，各組間切除腫瘤的重量和體積無(wú)明顯差異。記錄每組小鼠腫瘤體積，分析不同治療的結(jié)果。值得注意的是，DOX的治療明顯抑制了復(fù)發(fā)的肝腫瘤。其中DOX-ALG和DOX/ALR-MCMs組殘瘤體積明顯小于游離DOX組，兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)性差異，如圖4b、4c所示。然后，對(duì)反映腫瘤增殖情況的Ki67和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）進(jìn)行免疫組化（IHC）染色，評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的增殖情況。如圖4d所示，DOX-ALG組和DOX/ALR-MCMs組腫瘤細(xì)胞Ki67和PCNA的表達(dá)明顯較低，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制。此外， HE結(jié)果顯示，治療后各組小鼠的主要器官均無(wú)明顯損傷。這些結(jié)果表明，載藥MCMs為術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)提供了一個(gè)實(shí)用的解決方法。
圖4 (a)小鼠原位H22肝癌模型構(gòu)建及腫瘤切除后MCMs治療示意圖；(b)術(shù)后給藥后14天3組平行實(shí)驗(yàn)小鼠殘留腫瘤組織體積；(c) TUNEL凋亡試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)；(d)免疫熒光圖像和Ki67、PCNA免疫染色圖像評(píng)價(jià)；（e-g）Ki67、PCNA、TUNEL陽(yáng)性染色的腫瘤細(xì)胞定量統(tǒng)計(jì)。（比例尺為50 μm。* p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001）
一般來(lái)說(shuō)，術(shù)后化療可能存在增加肝損傷和導(dǎo)致肝功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。為了克服這一困境，我們將MCMs設(shè)計(jì)為同時(shí)加載DOX和ALR，從而在抗腫瘤治療和促進(jìn)肝再生中發(fā)揮雙重作用。為了確認(rèn)ALR負(fù)載MCMs切除后對(duì)小鼠的肝再生能力，我們將小鼠分為對(duì)照組、GelMA、A-ALR、ALR-GelMA和DOX/ALR-MCMs組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裝載ALR的GelMA微球和DOX/ALR的MCMs處理小鼠血清反映肝損傷的ALT和AST水平顯著降低（圖5b，5c），對(duì)肝損傷有修復(fù)作用。此外，IHC結(jié)果顯示，在ALR-GelMA組和DOX/ALR-MCMs組中，PCNA和Ki67的表達(dá)增加（圖5a）。這些結(jié)果表明，DOX/alr負(fù)載的MCMs對(duì)肝損傷有保護(hù)作用。
圖5 (a)Ki67和PCNA免疫染色圖像，用于分析各組肝細(xì)胞增殖活性；（b,c）Ki67和PCNA染色陽(yáng)性的肝細(xì)胞定量分析結(jié)果；（d,e）部分肝切除后48 h不同治療小鼠血清；(d) ALT和AST水平。（比例尺為50 μm。* p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001）
綜上所述，本文開(kāi)發(fā)了新型多組分微球，由DOX負(fù)載的ALG殼和ALR負(fù)載的GelMA核組成，實(shí)現(xiàn)腫瘤殺傷和肝再生的多功能，用于術(shù)后腫瘤治療。這些微球表現(xiàn)出獨(dú)特的“顆粒中顆?！睒?gòu)型，以及其他優(yōu)點(diǎn)，包括其尺寸均勻、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物相容性。受益于這些優(yōu)勢(shì)，微球使DOX快速釋放和ALR持續(xù)釋放，從而支持最初的抗腫瘤治療和持續(xù)促進(jìn)肝再生。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了腫瘤不完全切除合并肝部分切除的模型，證實(shí)了殘余腫瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制，并促進(jìn)了肝再生。此外，該微球具有藥物的時(shí)空釋放能力，可作為將兩種抗腫瘤藥物共封裝、實(shí)現(xiàn)協(xié)同和梯度抗腫瘤作用的良好平臺(tái)。