供稿人:周佳佳、王玲 供稿單位：機械制造系統(tǒng)工程國家重點實驗室 發(fā)布日期：2020-11-24
神經(jīng)回路的形成和發(fā)展在理解大腦機制方面起著關(guān)鍵作用。目前，研究人員已通過各種模型對神經(jīng)回路進行了廣泛研究，如動物模型和2D細胞培養(yǎng)模型，但由于動物與人類的固有差異及2D與3D模型行為的不同，使其應用受到限制。3D細胞打印作為一種新興的生物制造技術(shù)，已經(jīng)廣泛應用于體外組織研究，特別是神經(jīng)科學中的體外類腦組織構(gòu)建。
近期，清華大學與美國賓夕法尼亞州德雷塞爾大學研究人員提出了一種利用3D細胞打印技術(shù)制造的層狀體外類腦組織構(gòu)建體。該模型基于自然的大腦分層結(jié)構(gòu)，利用簡化的三層結(jié)構(gòu)用作神經(jīng)細胞生長的人工3D環(huán)境，每層厚500μm，結(jié)構(gòu)面積8×8 mm2，并具有網(wǎng)格營養(yǎng)支持系統(tǒng)，P01 Wistar大鼠皮質(zhì)初級神經(jīng)細胞通過細胞打印系統(tǒng)被引入結(jié)構(gòu)中。為模擬神經(jīng)細胞周圍環(huán)境，研究人員選擇并測試了由藻酸鹽、明膠和纖維蛋白原組成的生物墨水。交聯(lián)固化后，在樣品中加入補充有抑肽酶的新鮮培養(yǎng)基以保持打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。為提高細胞存活率，對噴嘴尺寸和打印速度進行了參數(shù)優(yōu)化，結(jié)果表明，噴嘴內(nèi)徑0.51mm、打印速度5ul·s-1是存活率為85%的優(yōu)化尺寸。
圖1 實驗過程的詳細說明
打印結(jié)構(gòu)在體外培養(yǎng)4周，活/死細胞檢測表明，第0天后，細胞均勻分布在結(jié)構(gòu)內(nèi)部，存活率在85%左右。在第7～28天，材料和培養(yǎng)基接觸的邊緣區(qū)域逐漸開始降解，但結(jié)構(gòu)彈性模量保持不變。細胞形態(tài)由圓形逐漸生長為定向的細胞束，軸突逐漸伸展并構(gòu)建神經(jīng)元之間的連接，從而推動神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成。
研究人員發(fā)現(xiàn)在長期培養(yǎng)過程中，從第7天開始，3D樣品的凋亡率明顯低于2D樣品。此外，在相同的刺激條件下，3D樣品中的峰值為0.6mV，比2D樣品大一倍，其歸因于3D模型中神經(jīng)元可以沿z軸方向擴展其生長空間，更多的神經(jīng)元連接在膜電極組件周圍的網(wǎng)絡(luò)中，產(chǎn)生更大的LFP信號。
此外，根據(jù)TTX藥物測試，當TTX被添加到培養(yǎng)物中時，可以穿透打印結(jié)構(gòu)并立即影響神經(jīng)元，EPSP(興奮性突觸后電位)信號顯著下降到零，這意味著神經(jīng)元活動受到TTX的強烈影響。這一結(jié)果表明這種打印結(jié)構(gòu)在藥物篩選未來應用中的巨大潛力。
圖2 (a-c)打印0天后的結(jié)構(gòu)形態(tài); (d-k)體外培養(yǎng)第7～28天打印結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)